【要闻】周景文教授综述：高通量筛选技术在工业生物技术的应用

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物质科学

physical science

工业技术利用微生物生产生物燃料、酶制剂、抗生素、生物材料、营养化学品等重要产品。 为了迅速有效地筛选更适合工业化生产的微生物菌株，自动化设备和快速测定方法迅速发展，在完全的背景下，各种高通量筛选( high-throughput screening，hts )战略应运而生

在cell press细胞出版社trends in biotechnology期刊上最近发表的综述“high-throughputscreeningtechnologyinindustrialbiotechnology”中， 来自江南大学陈坚院士团队的周景文教授课题组深入探讨了提高hts效率的重要因素，探讨了hts在加强工业微生物性能中的应用，以及在合成生物学、纳米技术和人工智能高速发展的背景下，工业生物技术中hts当前面临的挑战和

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工业微生物选育中的挑战

天然存在的微生物产量低，对工业条件的耐性差等不足很多。 这是因为很少直接用于工业生产。 为了克服这些问题，研究者目前正在开发各种战略，包括在基因层面改变微生物的生理功能，为菌株的生长和产物的积累提供最佳的环境。 经过这些改造用于工业生产的微生物通常被称为细胞工厂。

研究者一般采用随机或定向变异诱导的方法，提高目标产物在细胞工厂中的积累。 由于有益变异的概率可能非常低，因此在大型突变体库中开发快速筛选目标微生物菌株的方法尤为重要。 通常的筛选效率是焊剂低，检查慢，劳动强度高，所以筛选价格高，效率下降了。 比较上述问题，高通量筛选( hts )结合自动化和微定量实验以及大规模数据观察等先进手段，广泛应用于工业生物技术的基础和应用研究。

▲图1 .高通量筛选战略促进微生物细胞工厂同样产品的合成

多样化筛选文库构建:突变与进化

1 .诱变技术

诱变技术已经广泛应用于工业微生物的培育，至今仍被认为是产生优良工业微生物的比较有效的方法。 一般的物理化学诱变方法有紫外线、α射线、β射线、γ射线、x射线、烷基化剂、碱类似物等。 另外，室温常压等离子体( artp )和重离子等新的变异诱导方法也被广泛应用，与以前传来的方法相比，具有变异率高、随机变异部位多、不需要有毒有害化学品等特征。

2 .适应实验室进化( ale )

ale基于微生物通过有益的突变适应环境条件的能力，多与代谢工程和合成生物学战略相结合，构建更高效的微生物细胞工厂。 其典型应用是: ( I )加强微生物对恶劣环境的适应性；( ii )提高菌株的生长速度、基质消耗或产物积累能力；( iii )激活非天然物的合成或消耗非天然基质的潜在方法。 evolver、微滴微生物培养( mmc )系统等被设计为微生物高通量培养和适应性进化。 另外，根据ale的原理，基因组复制工程支持的连续进化( greace )系统也被开发用于强化菌株的性能(图2b )。

3 .定向进化

进化是改造酶的比较有效的方法，广泛应用于工业生物合成过程中。 根据构建突变基础的方法，定向进化可以分为非理性设计、理性设计和半理性设计。 非合理的设计不需要深入了解酶的序列和结构的随机进化策略，主要包括容易出错的pcr、dna的改组和饱和变异等(图2c )。 合理的设计是基于智能计算策略的改造方法，用于模拟天然酶的动力学和进化，通过这种方法可以更有效地筛选目标突变体。 半理性设计是非理性设计与理性设计相结合形成的，是目前应用最广泛的路径。

4 .随机装配

为了以更合理的方法构建菌株库，建立了基于启动子-5'-utr复合体和基因随机组装、多重自动化基因组工程( mage )、epathbrick、casemblr、compass等随机组装的策略 。 这些随机汇编策略有助于建立具有各种功能和协调单元的大文库。

▲图2 .微生物多样化菌株库的构建策略

扩大搜索范围:应用技术

1 .光谱学设备

高通量筛选的实现一般基于精确的高通量检测设备。 酶标记器是hts中最常用的设备，多功能酶标记器也广泛应用于细胞生长和凋亡、代谢物含量、酶活性等的检测。 另外，根据拉曼光谱等特殊光谱等开发了检测越来越多化学物质的设备，其中一个设备与流式荧光活化细胞分选( facs )、微流控制和光镊技术等协同应用，得到了更迅速的发展。

2 .自动化系统

自动化是hts的重要特征之一是进行微小定量实验和大规模分解的基础。 hts综合了一系列连续的自动化实验操作，经典的hts设备主要包括自动除菌器、移动液事业所、多功能酶标识器等。 另外，pcr计、离心机、灭菌系统、包装系统等一系列附属设备也经过相应的改进，集成到hts系统中，进一步提高筛选效率。

3.facs和微流控制技术

流式细胞术更迅速地分解细胞密度和大小、内部的多和杂度、其他荧光信号等各个细胞的许多参数，以多种玩法迅速地对目标用户进行分类，以高纯度和高通量筛选目标细胞 流式细胞术facs技术已成为基础生物学研究和工业应用不可缺少的工具。

微流控制技术是解决从微小上升到皮上升的液体的技术，其核心是被称为“芯片实验室”的微流控制芯片。 基于微流控制技术，研究者开发了单细胞分解的微流控制系统，具有高灵敏度、定量读出、准确性等优点。

facs通常用于细胞内荧光信号或膜结合产物的分解，但工业生物技术中很多目标产物是细胞外产物，facs的应用受到限制，微流控制技术的缺点是其筛选速度远远低于facs。 因此，微流控制和细胞筛选相结合的微流控制技术( fads )打破了传统的facs和微流控制技术的局限性，作为比较有效的识别和分离方法备受关注。

▲图3 .按筛选规模区分的高通量筛选过程

强调目标化合物:检测方法

1 .通过光信号进行筛选

目前，已经建立了多种基于紫外光/可见光谱、特殊光谱、荧光信号等的筛选方法。 紫外光/可见光谱及荧光信号检测法可以分为直接法和间接法(图4a、4b )。 具有特殊分子结构和颜色特征的物质可以通过直接测量吸光度进行筛选，而不具有直接吸光特征的物质可以通过加入ph指示剂、与金属离子螯合、或与酶促进和化学反应偶联来间接检测。 使用荧光染料和探针生成的荧光信号也广泛应用于工业微生物的筛选，基于荧光的hts也可以实现超高通量筛选( uhts )。

基于拉曼光谱，傅里叶变换红外( ftir )和傅里叶变换近红外( ftnir )光谱等特殊光谱的战略也应用于工业生物技术(图4e )。 。 这些方法具有快速、灵敏、无损、高通量、实时检测等特点，被用于单细胞和生物催化剂的无标记筛选。

2 .通过传感器筛选

由于某些目标物或重要的中间物不能通过直接或间接的颜色或荧光反应检测，因此高通量筛选技术的采用受到限制，基于各种传感器的筛选方法可以作为替代策略。 目前应用较多的是生物传感器( biosensor )和电化学传感器( electrochemical sensor，es )。 生物传感器由传感器元件和报告元件组成。 传感器元件识别特定的细胞内代谢物，通过一系列的基因电路从报告元件中生成定量的信号，迄今为止，正在开发基于蛋白质和核酸的生物传感器(图4c )。 电化学传感器利用电极表面发生的生化反应产生的电流变化进行检测，具有对目标高度敏感、选择性强、响应快等特点，广泛应用于临床诊断、食品中有害成分的分解和环境监测，目前es

▲图4 .常用高通量滤波器模型构建策略

本文参考文献(上下滑动看)

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论文作者的介绍

周景文

教授

周景文，江南大学教授，教育部青年长江学家，国家自然科学基金优秀青年科学基金获得者。 2003年毕业于华中农业大学本科，2006年毕业于华中农业大学硕士，2009年在江南大学取得工程博士学位。 2009年考入江南大学生物工程学院。 我在哈佛大学化学化学生物学系做博士后研究。 研究包括合成生物学在植物天然物合成和新资源食品中的应用。 最近五年，在metab. eng .、green chem .、microbiol. mol. biol. rev .、trends biotechnol .等发表了30篇论文 曾获得国家技术发明奖二等奖、中国专利金奖等科研奖励。 现任江南大学未来食品科学中心副主任、中国生物工程学会青年职工委员会副主任、《生物工程学报》、frontiersinbioengineeringandbiotechnology和electronicjournalofbiotechnology编

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▲论文标题:

high-throughputscreeningtechnologyinindustrialbiotechnology

▲论文网站:

cell/trends/biotechnology/full text/s 0167-7799 ( 20 ) 30001-9

▌doi :

doi/10.1016/j.tibtech..01.001

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原标题:“周景文教授综述:高通筛选技术在工业生物技术中的应用”

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